E3Switch DE3 Instrukcja Użytkownika Strona 43
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Ein Ansatz enthielt Protein und Toxin im Verhältnis von
∆DNT : GTPase 1 : 2
CNF1
full length
: GTPase 1 : 10
tTG (1µg/µl) 3 µl in 30 µl Ansatz
Ein Ansatz von 30 µl enthielt außerdem:
3 µl 10x-Transglutaminase-Puffer
5 µl gesättigte Monodansylcadaverin-Lösung
50 mM Tris/HCl pH 8,0 ad 30 µl.
In vivo laufen Transglutaminierungsreaktionen in leicht basischem Milieu ab. Daher wurde
für die Versuche mit Transglutaminasen Tris/HCl mit einem pH-Wert von 8,0 als Puffer
verwendet. Die gesättigte Monodansylcadaverin-Lösung wurde hergestellt, indem eine
Spatelspitze Monodansylcadaverin in 400 µl Tris/HCl pH 8,0 resuspendiert und gut gevortext
wurde. Nach dem Absinken des ausfallenden Monodansylcadaverins wurde der maximal mit
Monodansylcadaverin gesättigte Überstand a/jointfilesconvert/377385/bgenommen und für den Versuch verwendet. Die
Aktivität der Gewebstransglutaminase betrug 0,025 U/10 µl.
Um unspezifische Bindung des Monodansylcadaverins an die GTPase auszuschließen, wurde
je ein Ansatz mit und einer ohne Zusatz von Toxin inkubiert. Auf jedem Gel lief eine Probe
mit RhoA als Referenzwert mit.
Die Ansätze wurden nach Zugabe des Toxins 30 Minuten lang bei 29°C (DNT) bzw. 37°C
(CNF1 und tTG) inkubiert, die Reaktion mit Probenpuffer gestoppt und die Proben gekocht
und auf das Gel aufgetragen.
Das Gel wurde vor dem Färben unter einem UV-Leuchtschirm ausgewertet. Für die
qualitative Auswertung wurde das Fluoreszenzbild ausgedruckt. Die quantitative Auswertung
der Daten erfolgte mit Hilfe eines Computerprogramm (ImageQuant 5.2, Molecular
Dynamics). Dabei wurde die Fluoreszenz durch Densitometrie der Banden quantifiziert. Die
Fluoreszenz von RhoA diente als Referenzwert von 100%. Mittelwert und
Standardabweichung von je drei Versuchen pro GTPase wurden berechnet und graphisch
dargestellt.
- INAUGURAL-DISSERTATION 1
- Danksagung 3
- Mikrosomale 11
- Kernbildung 13
- Aktinfilamente 13
- Rho-inaktivierende Toxine 20
- Rho-aktivierende Toxine 20
- Gel nachgewiesen 42
- 1. Reaktion 44
- 2. Reaktion 44
- Transgluta 58
- 72 (Lerm, 1999a); 62
- RhoA Wildtyp RhoD D76E 66
- RhoA Wildtyp RhoA E64D 66
- Transglutaminierung[%] 69
- 59 78 63 64 65 68 71 72 76
- G Literaturverzeichnis 84
- V Abkürzungen 93
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