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Dass die Aminosäure 76 in RhoD bzw. 64 in RhoA auch für die Transglutaminierung durch

DNT notwendig ist, wurde durch die nächsten Versuche mit DNT bestätigt (Abb. D10). RhoD

D76E wird in geringem Ausmaß auch von DNT transglutaminiert, im Gegensatz zu RhoD

Wildtyp (nicht gezeigt) und RhoA E64D.

Abb. D10: Transglutaminierung durch DNT

Kosubstrat: Monodansylcadaverin; der Versuch wurde mit RhoD D76E zweimal (mit RhoA E64D einmal) mit

gleichem Ergebnis durchgeführt;

III RhoD D76E

III.1 Deamidierung von RhoD D76E

Die oben beschriebenen Versuche mit den mutierten Rho-GTPasen erbrachten das Ergebnis,

dass RhoD D76E im Gegensatz zu RhoD Wildtyp von CNF1 und DNT transglutaminiert

wird. Als nächstes sollte daher festgestellt werden, ob RhoD D76E auch durch CNF1

deamidiert wird, da CNF1 in vivo mehr Deamidierungsaktivität als

Transglutaminierungsaktivität aufweist.

Dazu wurden der Nachweis der Motilitätsänderung und der Westernblot eingesetzt. Der

Nachweis der Motilitätsänderung beruht darauf, dass das getestete Protein nach Deamidierung

durch CNF1 sein Laufverhalten ändert und im SDS-Gel langsamer wandert. Diese

Motilitätsänderung kann auf dem Gel beobachtet oder durch einen Westernblot mit einem

Antikörper gegen RhoA nachgewiesen werden.

Für diesen Versuch wurden als Kontrollen zwei weitere Mutanten hergestellt, RhoA

Q63E/E64D und RhoD Q75E/D76E. Diese Doppelmutanten dienten als Positivkontrollen, da

das Vorhandensein der Aminosäure Glutamat an Position 63 (RhoA) bzw. 75 (RhoD)

denselben Effekt auf das Laufverhalten im SDS-PAGE hat wie die Deamidierung durch

CNF1. Laufen die Doppelmutanten im SDS-Gel langsamer als die jeweilige Einfachmutante,

RhoA Wildtyp RhoD D76E

RhoA Wildtyp RhoA E64D

- + - + DNT - + - +

1 2 ... 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 ... 93 94

Brak uwag

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