E3Switch DE3 Instrukcja Użytkownika Pobierz pdf (Strona 47)

Die Berechnung des beladenen Anteils:

1 µg GTPase entspricht einer Menge von ca. 50 pmol GTPase

1 µl 200 µM [γ−

S]GTP entspricht einer Menge von 200 pmol [γ−

S]GTP

Mit Hilfe eines Dreisatzes konnte ausgehend von den oben genannten Angaben die Menge

des an die GTPase gebundenen [γ−

S]GTP berechnet werden:

200 pmol x Cpm

(Probe)

= x pmol an GTPase gebundenes [γ−

S]GTP

Cpm

(Referenz)

Der Anteil an gesamter GTPase auf dem Filter in Prozent wird berechnet wie folgt:

x pmol an GTPase gebundenes [γ−

S]GTP x 100

= Prozentsatz

50 pmol

Die GTP-Bindung wurde mit Hilfe von Graphen dargestellt.

2.6 Messung der GTPase-Aktivität

Anhand einer veränderten GTPase-Aktivität der Rho-GTPasen können Rückschlüsse auf ihre

Modifizierung durch CNF1 gezogen werden. Die GTPase-Aktivität wird durch die

Modifizierung durch CNF1 gehemmt, und das Rho-Protein wird konstitutiv aktiviert.

Für die Messung der GTPase-Aktivität werden die Proteine zunächst mit [γ−

P]GTP beladen.

Danach werden die intrinsische und die durch ExoS (ein GAP-Protein aus Pseudomonas

aeruginsa) stimulierte GTPase-Aktivität der Rho-Proteine gemessen. Durch die Hydrolyse

des GTP zu GDP wird das radioaktive γ-Phosphat a/jointfilesconvert/377385/bgespalten, und die Radioaktivität der

Probe nimmt im Zeitverlauf ab.

Die Proteine wurden vor der Messung der GTPase-Aktivität 3h lang bei 37°C mit CNF1

inkubiert. Der Reaktionsansatz enthielt:

Toxin und GTPase im Verhältnis 1 : 10

und als Pufferlösung:

4 µl 10x-CNF-Puffer

50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 40 µl.

1 2 ... 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 ... 93 94

Brak uwag

E3Switch DE3 Instrukcja Użytkownika Strona 47