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I Nachweis der korrekten Faltung der getesteten Rho-Proteine

Bevor Aussagen darüber gemacht werden können, ob ein rekombinantes Protein Substrat

eines Toxins ist, muss gewährleistet sein, dass das Protein in der korrekten Tertiärstruktur

vorliegt. Im Falle der Rho-GTPasen lässt sich aus der GTP-Bindung auf die korrekte Faltung

schließen, da nur eine korrekt gefaltete Rho-GTPase die Fähigkeit besitzt, GTP zu binden.

Für den Nachweis der GTP-Bindung wurde das radioaktiv markierte [γ−

S]GTP verwendet.

[γ−

S]GTP wird nicht durch die Rho-GTPasen hydrolysiert, so dass die GTP-Bindung

unabhängig von der intrinsischen GTPase-Aktivität gemessen werden kann.

Die Rho-GTPasen tauschen während der Inkubation mit [γ−

S]GTP kontinuierlich GDP

gegen GTP aus, wobei sie unterschiedliche Austauschraten aufweisen. Es resultiert eine

Beladung der Proteine mit [γ−

S]GTP, die zu mehreren Zeitpunkten anhand der

Radioaktivität gemessen wird.

In Abb. D1 ist beispielhaft für alle getesteten Rho-GTPasen die [γ−

S]GTP-Beladung von

RhoA, Cdc42, Rac1 und RhoG dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Rho-GTPasen jeweils

unterschiedliche GTP-Beladungsraten aufweisen. RhoA zeigt die schnellste [γ−

S]GTP-

Bindung. Auch die Mutanten der Rho-GTPasen wurden auf ihre [γ−

S]GTP-

Bindungsfähigkeit getestet. Alle getesteten GTPasen waren in der Lage, [γ−

S]GTP zu

binden.

Abb. D1: Messung der GTP-

Bindung

Gezeigt ist die [γ−

S]GTP-

Beladung der Rho-

GTPasen RhoA, Cdc42,

Rac1 und RhoG zu

verschiedenen Zeit-

punkten, gemessen in

Cpm (counts per minute).

Zeit (min)

0 20 40 60 80 100

Cpm

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Zeit (min)

0 20 40 60 80 100

Cpm

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

RhoA

Cdc42

Rac1

RhoG

Zeit (min)

0 20 40 60 80 100

Cpm

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Zeit (min)

0 20 40 60 80 100

Cpm

2000

4000

6000

8000

10000

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14000

RhoA

Cdc42

Rac1

RhoG

RhoA

Cdc42

Rac1

RhoG

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