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I DNT und CNF1

Substratspezifität

Die Transglutaminierung der Rho-GTPasen wurde mit Hilfe des fluoreszierenden

Kosubstrates Monodansylcadaverin nachgewiesen. Es wird an das Glutamin 63 der GTPase

angehängt und kann unter UV-Licht in der Proteinbande auf dem SDS-Gel nachgewiesen

werden. Die Deamidierung der GTPase kann anhand einer Motilitätsänderung der

Proteinbande in der SDS-PAGE oder durch die Messung der Ammoniakfreisetzung während

der Reaktion nachgewiesen werden.

Die Tests der Substratspezifität von DNT und CNF1 ergaben, dass RhoG und RhoD im

Gegensatz zu den anderen getesteten GTPasen weder durch CNF1 noch durch DNT

transglutaminiert werden. Eine Besonderheit von RhoG ist, dass es zwar durch CNF1

deamidiert, aber nicht transglutaminiert wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass CNF1 und DNT,

mit Ausnahme von RhoG, die gleiche Substratspezifität haben.

Eine Frage, die sich zur Deamidierung durch CNF1 stellt, ist, warum in den Versuchen die

Kontrollkurven, die die Ammoniakfreisetzung der Rho-GTPase ohne Toxin darstellen, auch

gering abfallen, also eine Ammoniakentstehung zeigen. Eine Ursache ließ sich nicht sicher

feststellen, aber möglicherweise entsteht in diesen Proben unspezifisch Ammoniak, z. B.

durch die Zersetzung des Proteins durch die Lichtstrahlung im Fluoreszenzspektrometer.

Aminosäuresequenzvergleich und Aminosäureaustausch

Um zu klären, welche Aminosäuren für die Substratspezifität relevant sind, wurden die

Aminosäuresequenzen der Switch-II-Regionen von RhoG, RhoD und RhoA verglichen und

nicht identische Aminosäuren ausgetauscht.

Über die Substratspezifität von CNF1 und DNT war zu Beginn der Arbeit bekannt, dass ein

Peptid von 20 Aminosäuren (As 59-78) für die Modifizierung durch CNF1, aber nicht die von

DNT, ausreicht. Innerhalb dieses Peptids sind die Aminosäuren 68 und 72 für die

Modifizierung durch CNF1 und DNT notwendig (Lerm, 1999a).

Die Versuche mit den RhoA-Mutanten ergaben, dass für die Transglutaminierung durch DNT

und CNF1 auch die Aminosäuren Glutamat 64 und Aspartat 65 von Bedeutung sind. Für die

Transglutaminierung durch DNT spielt außerdem Prolin 71 eine Rolle.

Deamidierungsversuche mit der RhoA-Mutante RhoA E64D zeigten, dass Glutamat 64 für die

Deamidierung durch CNF1 von Bedeutung ist.

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