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Abb. D12: Deamidierung durch CNF1

Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel; der Versuch wurde dreimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt;

III.2 GTPase-Aktivität von RhoD D76E

In einem weiteren Versuch wurde die Frage, ob eine Deamidierung stattfindet oder nicht,

nochmals untersucht und bestätigt. Die GTPase-Aktivität von RhoD D76E wurde nach

Deamidierung durch CNF1 gemessen.

Dafür wurde das Protein mit [γ−

P]GTP beladen, dessen radioaktives γ-Phosphat aufgrund

der intrinsischen GTPase-Aktivität der Rho-GTPase a/jointfilesconvert/377385/bgespalten wird. Die Proben wurden vor

der Messung der GTPase-Aktivität mit und ohne CNF1 inkubiert. Durch die Messung der

Radioaktivität kann man überprüfen, ob die GTPase-Aktivität als Folge einer möglichen

Deamidierung vermindert ist.

Der Vergleich von RhoA Wildtyp mit RhoA E64D ergab, döass die GTPase-Aktivität von

RhoA E64D nach der Behandlung mit CNF1 im Gegensatz zu RhoA Wildtyp gleich bleibt

(nicht gezeigt), d. h. es findet keine Deamidierung statt. Die GTPase-Aktivität von RhoD

D76E, die im Falle einer Deamidierung vermindert wäre, wird durch Inkubation mit CNF1

nicht verändert. Es konnte also keine Deamidierung von RhoD D76E nachgewiesen werden.

RhoA

Wildtyp

RhoD

Wildtyp

RhoD

D76E

RhoD

Q75E

D76E

- + - + - + - + CNF1

deami-

diert

Toxin-

Bande

RhoA

Wildtyp

RhoD

Wildtyp

RhoD

D76E

RhoD

Q75E

D76E

- + - + - + - + CNF1

deami-

diert

deami-

diert

Toxin-

Bande

1 2 ... 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 ... 93 94

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