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Für die Beladung mit [γ−

P]GTP wurde die GTPase 5 Minuten lang mit EDTA (10 mM) und

DTT (2 mM) bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von unmarkiertem GTP (2 mM) und MgCl

(35 mM) wurde der Beladungsvorgang a/jointfilesconvert/377385/bgeschlossen.

Zur Messung der intrinsischen GTPase-Aktivität wurden die beladenen Proteinansätze bei

37°C inkubiert und ihre Radioaktivität je zweimal zu den Zeitpunkten 0, 5, 10, 20 und 30

Minuten durch Auftragen auf Filterpapier gemessen. Zur Messung der stimulierten GTPase-

Aktivität wurde zusätzlich ein Ansatz mit ExoS (100 ng pro Filter) versetzt und nach 4

Minuten gemessen. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne CNF1.

Pro Filter enthielt jeder Ansatz:

1 µg GTPase

1 µl 100 mM DTT

1-5 µl 200 µM [γ−

P]GTP-Lösung

5 µl 100 mM EDTA

7 µl 250 mM MgCl

1 µl 100 mM unmarkiertes GTP und

50 mM PBS ad 50 µl.

Die Messung der Radioaktivität erfolgte in H

O im Szintillationszähler. Der Verlauf der GTP-

Hydrolyse wurde anschließend graphisch dargestellt.

II.3 Arbeiten mit DNA

3.1 Zielgerichtete Mutagenese und Polymerasekettenreaktion

Die Methode der zielgerichteten Mutagenese macht sich die Polymerasekettenreaktion (PCR)

zu Nutze, um Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen in Plasmid-DNA einzubringen.

Ein PCR-Ansatz enthält Plasmid-DNA, Primer, die Desoxyribonukleosidtriphosphate dATP,

dCTP, dGTP und dTTP (dNTPs) und eine hitzestabile DNA-Polymerase.

Die Reaktion erfolgt in drei Schritten: Der Denaturierung der doppelsträngigen Template-

DNA durch Erhitzen auf ca. 95°C, dem „Annealing“, bei dem sich die Primer durch

Abkühlung auf ca. 50-60°C komplementär an die DNA anlagern und einen Startpunkt für die

DNA-Polymerase bilden, sowie der DNA-Elongation, d. h. der Synthese von Doppelstrang-

DNA.

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